As enzimas de restrição são enzimas que cortaram o DNA de cadeia simples e dupla. Cada enzima de restrição possui uma sequência de nucleótidos específica, chamada de site de restrição, que reconhece e corta. As enzimas de restrição são usadas para seqüenciamento de DNA, análise mutacional e clonagem e amplificação de DNA. Os cientistas usam enzimas de restrição para inserir genes de interesse em vetores de expressão, moléculas de DNA que podem replicar separadamente do DNA cromossômico. O vector contendo o gene de interesse pode então ser introduzido em uma cepa bacteriana para expressão e caracterização de proteínas.
Vídeo do dia
Passo 1
Identifique os sites de enzimas de restrição no seu vetor, observando um mapa de restrição. O mapa de restrição indicará quais enzimas irão cortar seu vetor e onde.
Passo 2
Escolha uma enzima de restrição que também tenha um site presente na inserção de seu gene, observando a seqüência da inserção. Certifique-se de que o site de restrição esteja em uma posição em sua inserção que esteja fora do gene de interesse, de modo que você não perca nenhuma parte do gene.
Passo 3
Certifique-se de que não há duplicatas do site de restrição em qualquer lugar na sua inserção ou vetor de gene. Isso irá causar cortes múltiplos em seu DNA e dar-lhe dados enganosos.
Passo 4
Tente escolher as enzimas de restrição que cortaram com extremidades pegajosas, em vez de extremidades contundentes. As extremidades pegajosas ocorrem quando a enzima corta o DNA de cadeia dupla de forma escalonada, deixando uma saliência de uma única cadeia que facilita a fixação com um corte de inserção da maneira oposta. As extremidades bruscas ocorrem quando o DNA de cadeia dupla é cortado de forma suave, e estes são mais difíceis de anexar.
Passo 5
Escolha uma enzima de restrição diferente para ambas as extremidades da sua inserção para garantir que ela seja inserida no vetor na orientação adequada e para garantir que o vetor não se reattane a si mesmo.
Passo 6
Tente escolher duas enzimas de restrição que funcionam bem no mesmo sistema de buffer e temperatura. Se isso não for possível, execute cada digestão separadamente.
Coisas que você precisará
- Sequência de inserção de gene
- Mapa de restrição para vetor de escolha
- Lista de enzimas de restrição e seus sites cortados
Dicas
- Alguns programas da web foram desenvolvidos para identificar sites de restrição em uma seqüência de DNA rapidamente. Um desses programas é de New England BioLabs.
